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本制品是一种ATP依赖的双链RNA连接酶，可以用于双链RNA进行分子内的环化连接和分子间的线性连接。T4 RNA Ligase II与T4 RNA Ligase I(货号：YTB4026)不同的是，对双链RNA中的缺刻(nick)的连接活性要大大高于对单链RNA末端的连接活性。T4 RNA Ligase II也可用于双链核酸(RNA双链、RNA/DNA杂合链、DNA双链)分子内或分子间RNA链的3’羟基和DNA链的5’磷酸基的连接。T4 RNA Ligase II连接时需要5’磷酸和3’羟基的存在，可以是RNA链或DNA链的5’磷酸基和RNA链的3’羟基之间发生连接反应。

T4 RNA Ligase II催化dsRNA粘端连接的反应过程如下：

• 首先，T4 RNA Ligase II直接消耗ATP，形成中间产物T4 RNA Ligase II-AMP，并释放焦磷酸；
  
• 然后，T4 RNA Ligase II-AMP与dsRNA的缺刻处相结合，并将AMP从中间产物T4 RNA Ligase II-AMP中转移至dsRNA缺刻处的5'磷酸末端，形成腺苷酰化缺刻dsRNA中间产物；
  
• 最后，在T4 RNA Ligase II的催化下，dsRNA缺刻处的3'羟基进攻该缺刻处的5'磷酸基团，形成3'-5'磷酸二酯键，并释放出AMP。

本制品主要用于连接双链RNA中缺刻的连接(即双链RNA的粘端连接)，也可用于双链结构中，RNA 3’羟基与DNA 5’磷酸基的缺刻连接。


大肠杆菌表达的重组蛋白，表达基因为T4嗜菌体T4 RNA Ligase II。


One unit is defined as the amount of enzyme required to ligate 0.4μg of an equimolar mix of a 23-mer and 17-mer RNAs in a total reaction volume of 20μL in 30minutes at 37℃.
活性检测条件：
50mM Tris-HCl (pH7.5),2mM MgCl₂,1mM DTT,400μM ATP,37℃孵育30min。

组分	规格
T4 RNA Ligase II(10U/μL)	100μL
10×T4 Rnl2 Reaction Buffer	250μL
说明书	1份

保存：-20℃，有效期1年。


10mM Tris-HCl(pH7.5)，50mM KCl，35mM (NH4)2SO4，0.1mM EDTA，0.1mM DTT，50%(v/v)甘油。


10×T4 Rnl2 Reaction Buffer：
500mM Tris-HCl(pH7.5@25℃)，20mM MgCl₂，10mM DTT，4mM ATP。


85℃加热5分钟可使T4 RNA Ligase II失活；加入蛋白酶K或EDTA可抑制其活性。


不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。

• 如果连接底物为ssRNA，推荐使用T4 RNA连接酶I(货号：YTB4026)等系列产品。
  
• 可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如RNase抑制剂(货号：YT530)、DEPC水(货号：YT528)等。
  
• 本制品提供的10×T4 Rnl2 Reaction Buffer适用于RNA双链中缺刻的连接反应。如果用于RNA/DNA杂合链中RNA 3’羟基与DNA 5’磷酸基的缺刻连接时，需要将反应体系中的MgCl₂的终浓度提高至10mM，并在反应体系中加入终浓度为10～15%的聚乙二醇8000(货号：YTB0616)，这样可以显著提高酶活性，同时不影响反应特性。

本制品酶活性高，连接效率高于国外同类竞争产品。本制品催化双链RNA粘端连接的效果请参考图1。

图1.本制品和N公司的同类产品催化连接dsRNA粘端连接的效果图。RNA-1：5’-OH-GGGCUUUGCGUGGGUUU-OH-3’；RNA-2 (5’端磷酸化)：5’- pCUAUAGAAACCCACGCAAAGCCC-OH-3’，使用我司的5×RNA寡核苷酸退火缓冲液(货号：YT529)，参考说明书进行退火反应。退火获得的dsRNA，在20μL反应体系中加入图中指定量的本制品或竞品，37℃孵育30min进行连接反应，反应完毕后立即取样用15%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。如图所示，本制品与竞品相比，实际的连接效率约为竞品的2倍，在本反应体系中百奥莱博的T4 RNA Ligase II仅需2U就可以非常充分地完成连接反应。

• 双链RNA或DNA/RNA杂合双链的退火。
  将两条单链RNA等摩尔数混合，推荐的终浓度为20μM (10～50μM均可)，90℃孵育1min，然后通过梯度降温至25℃退火形成dsRNA。推荐使用5×RNA寡核苷酸退火缓冲液(货号：YT529)，并按照该产品使用说明进行退火反应。DNA和RNA杂合链的退火也可以参考双链RNA的退火条件进行。退火后的双链推荐在-80℃保存。
  
• 反应体系
  
  • 对于双链RNA缺刻的连接，参考下表在冰浴中配制如下反应体系：
    

    成分	用量	终浓度
    DEPC-treated Water	16μL	-
    Nicked dsRNA Substrate (20μM)	1μL	1μM
    10×T4 Rnl2 Reaction Buffer	2μL	1×
    T4 RNA Ligase II(10U/μL)	1μL	0.5U/μL
    总体积	20μL	-

    
    注：
    
    • 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。本反应体系中涉及双链RNA，双链RNA可以耐受RNase A和T1等。如果涉及单链RNA，包括双链退火后存在部分RNA序列是单链的情况，推荐适量添加RNase Inhibitor。
      
    • 如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除Nicked dsRNA Substrate之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
      
    • 反应体系中的Nicked dsRNA Substrate的最终浓度可以达到1μM，在该反应体系中可以确保充分连接。实际使用过程中，例如由于底物量有限等原因，可以适当减少Nicked dsRNA Substrate的用量，例如使最终浓度为0.5μM或0.2μM等。
  • 对于RNA/DNA杂合链中RNA 3'羟基与DNA 5'磷酸基的缺刻连接，参考下表在冰浴中配制如下反应体系：
    

    成分	用量	终浓度
    DEPC-treated Water	10.4μL	-
    Nicked DNA/RNA Substrate (20μM)	1μL	1μM
    10×T4 Rnl2 Reaction Buffer	2μL	1×
    PEG8000(50%,RNase Free)	4μL	0.1
    MgCl2(100mM,DEPC-treated)	1.6μL	8mM
    T4 RNA Ligase II(10U/μL)	1μL	0.5U/μL
    总体积	20μL	-

    
    注：
    
    • 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。本反应体系中涉及双链RNA，双链RNA可以耐受RNase A和T1等。如果涉及单链RNA，包括双链退火后存在部分RNA序列是单链的情况，推荐适量添加RNase Inhibitor。
      
    • 如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除Nicked DNA/RNA Substrate之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
      
    • 反应体系中的Nicked dsRNA Substrate的最终浓度可以达到1μM，在该反应体系中可以确保充分连接。实际使用过程中，例如由于底物量有限等原因，可以适当减少Nicked dsRNA Substrate的用量，例如使最终浓度为0.5μM或0.2μM等。
• 连接反应
  37℃孵育30min。如果发现效果欠佳可以尝试25℃孵育2h。为了使连接反应更加充分，可以适当延长连接反应时间。
  
• 终止反应
  反应结束后加入蛋白酶K或EDTA，即可终止反应。
  由于T4 RNA Ligase II热失活需要85℃加热5min，这样可能导致dsRNA或DNA/RNA杂合双链变性，因此通常不建议通过加热方式失活T4 RNA Ligase II。如果后续无需保持双链状态，则推荐85℃加热5min以失活T4 RNA Ligase II。

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